Tüm ekipmanınızı sırt çantanızda bir dalış teknesine getirip DNA barkodlama yapabilir misiniz? Peki tek seferde kaç türü dizileyebilirsiniz? Singapur’dan bir grup araştırmacı bunu bir meydan okuma olarak ele aldı! Bento Lab ve MinION kullanılarak barkodlanan ilk ve en büyük örneklerden birini ortaya koydu.
Sahada Biyoçeşitlilik Araştırması
Taşınabilir in-situ DNA barkodlama, biyoçeşitlilik çalışmaları için potansiyel vaat eden bir yaklaşımdır. Toplanan örnekler hakkında saha çalışması esnasında hızlıca bilgi verebilir. Böylece örneklerin araştırma merkezine gönderilmesi ve analiz edilmesiyle yaşanan zaman kaybı önlenebilir. Yine de dönemin in-situ DNA barkodlama yaklaşımları yalnızca birkaç örneği çalışabilmeye izin veriyordu. Bu da onları bilimsel açıdan yetersiz ve örnek başına maliyet anlamında pahalı yöntemler yapıyordu. Bu sorunu çözmek için Ulusal Singapur Üniversitesi’nden bir ekip, in-situ dizilemenin sınırlarını zorlamaya karar verdiler.
Amaçları tek bir günün içinde dalış teknesiyle açılıp yumuşakçalar ve deniz yıldızları gibi sucul hayvanları toplayıp işleyerek DNA barkodlama için iş akışı oluşturmaktı. Tek bir PCR veya inkübasyon çalışmasında 32 numune çalışabilen Bento Lab’ı seçtiler.
Chang ve ekibi, sınırlı alana sahip dalış teknelerinde, kurulduğunda az yer kaplayacak şekilde tasarlanmış cihazlarıyla bir sistem kurdu. Bu sistem 32 kuyucuklu PCR kapasitesine sahip Bento Lab, dizileme cihazı Oxford Nanopore MinION ve bir dizüstü bilgisayardan oluşuyordu.
İş akışlarının üç ana gereksinimi vardı:
Sucul hayvanlardan başarıyla DNA ekstraksiyonu ve amplifikasyonu yapmak
PCR ürünlerinin poollanmasıyla bir kütüphane oluşturulması ve dizilenmesi
Dizileme sonrası bir biyoinformatik iş akışıyla dizilerin hangi türlere ait olduğunun belirlenmesi
Metodoloji
32 örnek için 20 dakikada DNA ekstraksiyonu yapmak üzere ısı bazlı tek adımlı bir enzimatik metot izlediler. Amplifikasyon aşamasında geniş organizma yelpazesinde PCR başarısını arttırmak için kısa bir COI barkod bölgesine yönelik dejenere metazoan primerlerini seçtiler. Dizilemeden önce PCR ürününün daha hızlı bir şekilde poollanmasını sağlamak ve okumaların daha sonra örneklere demultiplex edilmesine izin vermek için, 13 bp indeksler kullanarak her örnek için benzersiz primerler tasarladılar. Böylece dizileme iş akışında ayrı bir indeks ligasyonu adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırdılar.
Araştırmacılar, hızlı taşınabilir iş akışlarının klasik laboratuvarlardaki iş akışıyla karşılaştırıldığında ne kadar başarılı olacağını bilmek istediler. Bundan dolayı, saha çalışmalarından önce, 2017-2019 yılları arasında fenol:kloroform ve kit DNA ekstraksiyon yöntemleri kullanılarak 11 şubeden toplanan 151 örneği Illumina MiSeq platformunda dizileyerek bir karşılaştırma verisi ürettiler.
Aynı zamanda, yeni saha örnekleriyle birleştirmek için taşınabilir iş akışlarını kullanarak aynı örneklerden DNA ekstrakte edip amplifikasyon gerçekleştirdiler. Bunu yaparak, klasik laboratuvar ve saha dizileme veri setleri arasındaki başarı oranlarını karşılaştırabildiler. Daha uzun bir saha gezisi sırasında kaç örneğin DNA’sını barkodlayabileceklerini simüle edebildiler.
Yerinde saha dizileme iş akışının (sağda) tipik bir laboratuvar tabanlı yeni nesil dizileme iş akışıyla (solda) karşılaştırmalı şematik gösterimi. CC-BY 4.0 Chang et al. (2020).
Ekip, iş akışlarının planlamasından memnun olduktan sonra, Singapur’daki Sisters Adaları Deniz Parkı’ndan numune toplamak için bir dalış gemisiyle SCUBA dalışı yaptı. Barkodlamaya geçmeden 31 örnek topladılar.
MinION, ekip eve dönmeden önce akış hücresinin 50 dakika çalıştırılmasıyla saha ve laboratuvar amplikon poollarının dizilenmesi için kullanıldı.
Sonuçlar
Çalışmada, 105’i MinION dizileme yoluyla üretilen 147 benzersiz DNA barkodu ve mevcut Singapur barkod veritabanı için yeni olan 70 dizi üretildi. Bu, bölgeden bilinen barkodlu taksonlarda hızlı ve nispeten düşük bir maliyetle elde edilen önemli bir artışı temsil etmektedir.
Araştırmacılar, fenol; kloroform ve kit ekstraksiyonları kullanılarak elde edilen yaklaşık %77’lik laboratuvar başarı oranına kıyasla yaklaşık %60’lık bir saha dizileme başarı oranı bildirdi. Başarısızlıkların, çıkarılması zor dokular veya bazı türler için optimal olmayan primer eşleşmesi nedeniyle, dizilemeden ziyade DNA ekstraksiyonu ve PCR’ın bir sonucu olduğu ortaya çıktı. Ancak, yeni saha koleksiyonları da dahil olmak üzere tüm süreç yalnızca dokuz saat sürdü ve araştırmacılar işe yaramayan örnekler üzerinde döndüklerinde yeniden deneme yapabildiler.
Araştırmacılar elde ettikleri sonuçlara dayanarak şu sonuca vardılar:
“Sırt çantasında dizileme laboratuvarı” kurulumu, özellikle sahada barkodlamanın gerekli olduğu ama laboratuvar olanaklarının eksik olduğu durumlarda, keşif gezilerinde veya saha kurslarında dizileme kapasitesini büyük ölçüde artırabilir.
Numune başına maliyetleri azaltmanın anahtarı numune sayısını arttırmaktı. Bunu başarmak için Bento Lab’ın 32 kuyulu termal döngüleyicisi ve hızlı bir DNA ekstrasyon yöntemi kritik öneme sahipti.
R10.3 akış hücresini kullanan MinION ile dizileme doğruluğu neredeyse mükemmeldi ve örneklerin ~%80’inde Yüksek Doğruluklu basecalling modeli kullanıldığında hiçbir belirsizlik gözlenmedi. Tüm barkodlar için yeterli dizi kapsamı yalnızca ~50 dakikada elde edildi, bu da akış hücresi kapasitesinin çoğuna ihtiyaç duyulmadığı anlamına geliyordu.
Bunun, özellikle bir dalış teknesinden ve fazlasıyla geniş bir taksonomik grup yelpazesiyle, saha dizilemesinde ilham verici bir adım olduğunu düşünüyoruz!
Aynı zamanda, Bento Lab’ın sahadaki numune verimini artırarak Singapur’un deniz biyoçeşitliliğine dair bilgi birikimine katkıda bulunmasını okumaktan gerçekten mutlu olduk. Bu çalışmada kullanılan metodolojinin, yakın gelecekte benzer biyoçeşitlilik çalışmaları yapacak araştırmacılara faydalı olacağını umuyoruz.
