A Grubu Streptokok (GAS), boğaz enfeksiyonu (farenjit), bademcik enfeksiyonu (tonsillit), kızıl, cilt yaraları (impetigo) ve cilt enfeksiyonuna (selülit) neden olabilen bir bakteri türüdür. Nadiren, invazif A grubu streptokok hastalığı olarak da bilinen ciddi, potansiyel olarak hayatı tehdit eden enfeksiyonlara neden olabilir.
COVID-19 pandemisi sırasında, muhtemelen toplum izolasyonu nedeniyle azalmış olan prevalansı, Aralık 2022’de başlayan normalleşme döneminden bu yana pandemi öncesi döneme kıyasla 4 kat artmıştır. Hatta öyle ki, invazif vakalarda hastalar hayatlarını kaybetmişlerdir.
Artan vakaları ve mortaliteyi araştırmak amacıyla Prof Dr. Gülay Korukluoğlu, GAS’ta sıklıkla görülmeyen tutulum bölgelerini gösteren üç farklı klinik örnek (plevra mayii, kan, idrar) ile webinar’da bahsedilen araştırmayı yürüttü. İzole edilen GAS suşlarına, tarafımızca Oxford Nanopore dizileme kullanılarak tüm genom sekans analizi yapıldı ve NCBI GenBank boğaz sürüntüsü izolatlarına ait virülans faktörleri ile karşılaştırmalı olarak incelendi.
Ankara Bilkent Şehir Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü Bakteriyoloji Laboratuvarında plevra sıvısı, kan ve idrar örneklerinden izole edilen üç grup A beta hemolitik streptokok (GAS) suşu kültürde çoğaltıldı. Tüm hastalar için 35-37ºC’de 18-24 saat inkübasyondan sonra üreyen koloniler MaldiTof ile tanımlandı. Tüm izolatlar -80 °C’de kriyotüplerde saklandı ve Massive Bioinformatics’e gönderildi.
Massive Bioinformatics firması Satış Müdürü Seray Karaçay, kullanılan Oxford Nanopore Teknolojilerinin bakteriyal tüm genom analizi için uygunluğundan bahsederek anlatmaya başladı. Elde edilen izolatlardan DNA izolasyonu yapıldıktan sonra genomik DNA’lar dizilendi.
Oxford Nanopore, genomu fragmente etmeden dizileme işlemini gerçekleştirdiği için uzun okumalarla tüm genomu bir araya getirmek daha kolay ve keskin bir sonuç verir. Elde edilen diziler de novo assembly yapılarak daha uzun contigler haline getirildi.
NCBI BLAST ile nt veritabanında taratıldıktan sonra en yakın olduğu GAS suşunu bulmak için NCBI veri tabanından bu türe ait genomların hepsi ile yeni bir veritabanı oluşturuldu. Örneklere ait okumalar, yeni oluşturulan veritabanındaki GAS suşlarına hizalandı. En yakın GAS suşu belirlendikten sonra Virülans Faktör Veritabanı kullanılarak virülans faktörleri araştırıldı.
İzolatlara ait virülans faktörleri karşılaştırıldığında
- Sortase A,
- Streptokokal lipoprotein rotamase A (SlrA),
- Streptokokal kompleman inhibitör (SIC),
- Streptokokal pirojenik ekzotoksin J (SpeJ),
- Streptolizin S (SLS)
faktörlerinin boğaz sürüntüsü izolatlarında ya hiç bulunmadığı ya da en fazla birinde olduğu, buna karşılık çalışmada incelenen üç izolattan en az ikisinde saptandığı görüldü.
Yapılan bu analizler ışığında Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu, analizlerin sonuçlarını şöyle yorumladı:
“GAS enfeksiyonlarının klinik şiddetini tahmin etmede EMM serotiplerinin tek başına değerlendirilmesi yerine virülans faktörleriyle birlikte değerlendirilmesinin daha yararlı olabileceği, ayrıca farklı hücre tiplerinde virülans faktörlerinin kullandığı yolakların ve epigenetik modifikasyonlarla gen ekspresyonunda meydana gelebilecek değişikliklerin daha fazla araştırılmasının faydalı olabileceği düşüncesindeyiz.”
Soru & Cevap kısmı:
Soru: GAS enfeksiyonlarının artışını tetikleyen faktörler neler olabilir? Klinik vakalardaki artışla virülans faktörlerinin doğrudan bir ilişkisi olduğunu düşünüyor musunuz?
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Pandemi sürecinde alınan izolasyon önlemlerinin, özellikle çocuklarda veya yaşlılar gibi duyarlı gruplarda hassasiyete neden olmuş olabileceğini düşünüyorum. Pandemi sonrasında artan GAS vakalarının, bu grupların 2 sene boyunca herhangi bir mikroorganizma ile karşılaşmamalarının ardından normalleşme sürecinde birdenbire karşılaşılan mikroorganizmalardan daha agresif bir etki gördüklerini öngörüyorum. Ayrıca COVID enfeksiyonuyla ortaya çıkan immün yanıt değişikliklerinin bir sonucu olarak basit enfeksiyon türlerinde bile ağır etkiler görebiliyoruz. Bu şekilde gelişen bir immün yanıtın da GAS enfeksiyonunda klinik şiddeti arttırmış olabileceğini düşünüyorum.”
Soru: Araştırmanızda Sortaz A ve Streptolizin S gibii virülans faktörlerinin varlığını araştırdınız. Bu faktörlerin GAS enfeksiyonlarının klinik şiddeti üzerinde etkisi olabileceğini düşünüyor musunuz?
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Düşünüyorum ancak yürüttüğümüz çalışma bu ifadeyi kanıtlamak için yeterli örnek sayısını karşılamıyor, yani bir pilot çalışma gibi düşünülebilir. Daha fazla sayıda vakadan izolat alınıp sekans yapılarak aynı paterni gösterip göstermediğinin incelenmesi çok kıymetli olur diye düşünüyorum.”
Soru: Uzun okuma teknolojisinin araştırmanızda size sağladığı avantaj ne oldu?
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Viral bir ajanın sekansını kısa okuma teknolojileriyle yaptığınızda hedeflediğiniz bir gen bölgesi vardır ve buna yönelik primerlerle o bölgenin sekansını çıkarabilirsiniz. Ancak bakterileri bu bağlamda araştırmak için daha geniş bir veri kümesine ihtiyaç vardır. Bu nedenle Oxford Nanopore, bakteri tüm genom dizileme için önemli olan uzun okuma teknolojisini bize sağladı.”
Soru: Bu araştırmalar, enfeksiyonların önlenmesinde veya erken teşhisinde virülans faktörleri ve genetik analizler nasıl rol oynayabilir?
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Birincisi ve en önemlisi, ülkemize ait bir veri bankası oluşturulabilir. Ülkemiz için özellikle salgın potansiyeli taşıyan bütün enfeksiyon hastalıkları için böyle bir veri tabanı kıymetli olacaktır. İkinci olarak, kültür yöntemi enfeksiyonun tanımlanması için bir altın standarttır, yine de hız da bizim için oldukça önemli olduğu için hızıyla ön plana çıkan sekans çalışmaların çok önemli bir yeri var. Elbette tüm vakalar için sekanslama yapmak maliyet etkin olmayacaktır ancak sekanslama içeren araştırmalarla diğer tekniklerin kullanımı (kullanılacak primerlerin ve belirteçlerin keşfi gibi) için avantaj sağlar.”
Soru: Sekanslama tekniğinin klinikte yaygınlaştırılması için nasıl bir yol izlenebilir?
Seray Karaçay: “Sekanslama tekniği şu anda klinikte kullanılan diğer tekniklere göre biraz pahalı olsa da numune sayılarının artması, Oxford Nanopore özelinde birim maliyeti düşüren bir etkindir. Şirketimiz özelinde ise kliniğe entegrasyon açısından geliştirmekte olduğumuz projeler mevcut. Her örneğe sekanslama yapılmasına ihtiyaç bulunmamakla birlikte özellikle sekanslama ihtiyacı bulunan vakalar vardır. Özellikle kültürlenemeyen veya MaldiTof yönteminden kaçan mikroorganizmalar için de tür tayini sağlayabilmesi, sekanslamayı daha yaygın hale getirecek olan önemli bir nokta.”
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Şahsen bebek hastalarda alınan örneklerin çok kısıtlı olması nedeniyle sekanslamanın önemli olduğunu düşünüyorum. Duyarlı veya onkolojik hasta grupları gibi atipik immün yanıt gösteren hastalarda da fırsatçı enfeksiyonların tanımlanmasında hız kazandıracaktır.”
Soru: Oxford Nanopore Teknolojileri kullanıcılarının bu konuda geri bildirimleri nasıl?
Seray Karaçay: “Oxford Nanopore Teknolojileri de biz Massive Bioinformatics de yalnızca bu alanda değil; kanser, çevre, ziraat, zooloji gibi çeşitli alanlarda hizmet veriyoruz. Yine de mikrobiyoloji bizim için daha özel bir alan, oldukça optimize ve oturmuş bir sistemimiz var. Dolayısıyla mikrobiyoloji alanında çalışan kullanıcılarımıza gönül rahatlığıyla cihazları sunabiliyoruz. Örneğin hedefli PCR yöntemiyle hastanın kliniğini açıklayamayan bir müşterimiz, vakayı shotgun dizileme ile aydınlatmak istiyordu. Örneğini bize gönderdikten sonra sekanslama sayesinde örneğinde hangi mikroorganizmaların olup olmadığını tespit edebildik. Özellikle Oxford Nanopore’un optimizasyonunu ve doğruluk oranlarını arttırmasıyla geri dönüşlerimiz de iyiden daha iyiye doğru gidiyor!”