“Doğrudan RNA dizileme olmadan, bu verileri elde etmek için birçok farklı deney yapmamız gerekirdi… şimdi ise tüm bu bilgilere tek bir deneyle ulaşabiliyoruz.”
— Josie Gleeson, Melbourne Üniversitesi, Avustralya
Nanopore, native RNA transkriptlerini doğrudan okuyabilen tek mevcut teknolojidir. Bu yenilikçi yöntem, PCR nedenli hataları olmadan gen ve izoform ekspresyonunu niceliksel olarak belirlemeyi ve RNA modifikasyonlarını tespit etmeyi mümkün kılar. Uzun nanopore okumaları sayesinde, izoformlar tam uzunlukta çözümlenebilir ve poli-A kuyruk uzunlukları yüksek doğrulukla analiz edilebilir.
Doğrudan RNA Dizileme Nedir?
Doğrudan RNA dizileme (Direct RNA Sequencing), RNA moleküllerinin cDNA’ya dönüştürülmeden, yani native halleriyle okunmasını sağlayan bir teknolojidir. Bu yöntemin sunduğu en büyük yeniliklerden biri, RNA üzerindeki modifikasyonları ve izoform çeşitliliğini bozulmadan analiz edebilmesidir. Oxford Nanopore Teknolojisi’nin sağladığı bu yöntem, alternatif izoformları belirleme, RNA modifikasyonlarını saptama ve poli-A kuyruk uzunluğunu hassas bir şekilde ölçme gibi imkanlar sunarak RNA biyolojisinin daha derinlemesine incelenmesini sağlar.
Nanopore Teknolojisi Nasıl Çalışır?
Oxford Nanopore’un geliştirdiği doğrudan RNA dizileme teknolojisi, membran içine gömülü biyolojik porlar kullanarak RNA dizilerini okur. RNA, bir motor protein yardımıyla nanopordan geçirilirken, her bazın (A, U, G, C) elektriksel sinyal profili kaydedilir. Bu sayede RNA dizisi gerçek zamanlı olarak okunur ve herhangi bir PCR amplifikasyonu veya cDNA dönüşümü gerektirmez.
Bu yöntemin avantajları şunlardır:
Uzun Okuma Kapasitesi: RNA transkriptleri tam uzunlukta okunabilir.
PCR nedenli hatalar olmadan Doğrudan Dizileme: RNA’nın doğal modifikasyonları korunur.
RNA izoformlarının belirlenmesi : Kısa okuma yöntemlerinde olduğu gibi izoformları tahmin etmeye gerek kalmaz.
Poli-A kuyruğu uzunluğunun ölçülmesi: Post-transkripsiyonel düzenleme mekanizmaları daha iyi anlaşılır.
Nanopore RNA Dizilemenin Araştırmalara Katkıları
Nanopore RNA dizileme, birçok bilimsel alanda hastalıklara dair daha net bilgiler edinilmesini, yeni biyobelirteçlerin keşfedilmesini ve genetik varyasyonların daha doğru analiz edilmesini sağlıyor.
Aşağıdaki video, doğrudan RNA dizilemenin araştırmalara nasıl katkı sağladığını açıklıyor:
1️. Tam Uzunlukta Transkript Analizi
Geleneksel kısa okuma teknolojileri, RNA transkriptlerini küçük parçalara bölerek okur ve bu parçaları daha sonra birleştirmeye çalışır. Ancak, RNA transkriptleri genellikle 1-2 kb uzunluğunda olup, bazıları 100 kb’ye kadar çıkabilir. Kısa okuma teknolojileriyle yapılan analizlerde birleştirme hataları ve yanlış hizalamalar ortaya çıkabilir. Nanopore dizileme, RNA transkriptlerini tam uzunlukta okuyarak bu sorunları ortadan kaldırır.
2. Alternatif İzoformların Doğrudan Tespiti
Alternatif splicing, genlerin farklı proteinler kodlayan çeşitli izoformlar üretmesini sağlar. Geleneksel dizileme teknikleri ile alternatif izoformlar yalnızca dolaylı tahminlerle belirlenebilirken, Nanopore teknolojisi ile doğrudan ve eksiksiz olarak tespit edilebilir.
Örnek: 88 insan örneğinde yapılan çalışmalarda, 70.000’den fazla yeni transkript keşfedilmiştir.
3️. RNA Modifikasyonlarının Analizi
RNA üzerinde N6-methyladenosine (m6A), pseudouridine (Ψ) ve inosine (I) gibi çeşitli modifikasyonlar bulunur. Bu modifikasyonlar, RNA’nın stabilitesini, translasyon verimliliğini ve fonksiyonlarını doğrudan etkileyebilir.
Geleneksel cDNA dizileme yöntemleri, bu modifikasyonları kaybederken, Nanopore doğrudan RNA dizileme yöntemi bu modifikasyonları doğrudan okuyabilir.
4️. Poli-A Kuyruk Uzunluğunun Ölçülmesi
RNA transkriptlerinin poli-A kuyruğu, translasyon düzenlemesi ve RNA stabilitesi için kritik öneme sahiptir. Nanopore dizileme sayesinde, farklı poli-A kuyruk uzunluklarının gen ekspresyonunu nasıl etkilediği daha iyi anlaşılabilir.