A Grubu Streptokok (GAS), boğaz enfeksiyonu (farenjit), bademcik enfeksiyonu (tonsillit), kızıl, cilt yaraları (impetigo) ve cilt enfeksiyonuna (selülit) neden olabilen bir bakteri türüdür. Bununla birlikte, nadiren invazif A grubu streptokok hastalığı olarak da bilinen ciddi ve potansiyel olarak hayatı tehdit eden enfeksiyonlara neden olabilir.
COVID-19 pandemisi sırasında GAS enfeksiyonlarının görülme sıklığı, muhtemelen toplum izolasyonu nedeniyle azaldı. Ancak, Aralık 2022'de başlayan normalleşme döneminden bu yana vaka sayısı pandemi öncesi döneme kıyasla 4 kat arttı. Ayrıca, invazif vakaların bir bölümünde hastalar hayatlarını kaybetti.
GAS Enfeksiyonlarındaki Artış ve Araştırmanın Amacı
Bu nedenle, artan vakaları ve ölüm oranını araştırmak amacıyla Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu, GAS'ta sıklıkla görülmeyen tutulum bölgelerini gösteren üç farklı klinik örnek (plevra sıvısı, kan ve idrar) ile webinar’da bahsedilen araştırmayı yürüttü. İzole edilen GAS suşlarına tarafımızca Oxford Nanopore dizileme kullanılarak tüm genom dizileme analizi yapıldı. Daha sonra, elde edilen sonuçlar NCBI GenBank boğaz sürüntüsü izolatlarına ait virülans faktörleri ile karşılaştırmalı olarak incelendi.
Oxford Nanopore ile Tüm Genom Dizileme Süreci
Ankara Bilkent Şehir Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü Bakteriyoloji Laboratuvarında plevra sıvısı, kan ve idrar örneklerinden izole edilen üç grup A beta hemolitik streptokok (GAS) suşu kültürde çoğaltıldı. Tüm hastalar için 35-37ºC'de 18-24 saat inkübasyondan sonra üreyen koloniler MaldiTof ile tanımlandı. Ardından, tüm izolatlar -80 °C'de kriyotüplerde saklandı ve Massive Bioinformatics’e gönderildi.
Massive Bioinformatics firması Satış Müdürü Seray Karaçay, kullanılan Oxford Nanopore Teknolojilerinin bakteriyal tüm genom analizi için uygunluğundan bahsederek anlatmaya başladı. Elde edilen izolatlardan DNA izolasyonu yapıldı. Sonrasında, genomik DNA’lar dizilendi.
Oxford Nanopore, genomu fragmente etmeden dizileme işlemini gerçekleştirdiği için uzun okumalarla tüm genomu bir araya getirmek daha kolay ve keskin bir sonuç verir. Bu sayede, elde edilen diziler de novo assembly yapılarak daha uzun contigler haline getirildi.
Diziler NCBI BLAST ile nt veritabanında taratıldı. Daha sonra, en yakın GAS suşunu bulmak amacıyla NCBI veri tabanındaki bu türe ait genomların tamamı kullanılarak yeni bir veritabanı oluşturuldu. Örneklere ait okumalar bu veritabanındaki GAS suşlarına hizalandı. Son olarak, en yakın GAS suşu belirlendikten sonra Virülans Faktör Veritabanı kullanılarak virülans faktörleri araştırıldı.
Tespit Edilen Virülans Faktörleri
İzolatlara ait virülans faktörleri karşılaştırıldığında şu faktörler öne çıktı:
- Sortase A
- Streptokokal lipoprotein rotamase A (SlrA)
- Streptokokal kompleman inhibitör (SIC)
- Streptokokal pirojenik ekzotoksin J (SpeJ)
- Streptolizin S (SLS)
Bu faktörlerin boğaz sürüntüsü izolatlarında ya hiç bulunmadığı ya da en fazla bir izolatta bulunduğu görüldü. Buna karşılık, çalışmada incelenen üç izolattan en az ikisinde bu faktörler saptandı.
Araştırmanın Bulguları ve Değerlendirilmesi
Sonuç olarak, yapılan analizler ışığında Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu araştırmanın sonuçlarını şöyle yorumladı:
“GAS enfeksiyonlarının klinik şiddetini tahmin etmede EMM serotiplerinin tek başına değerlendirilmesi yerine virülans faktörleriyle birlikte değerlendirilmesinin daha yararlı olabileceği, ayrıca farklı hücre tiplerinde virülans faktörlerinin kullandığı yolakların ve epigenetik modifikasyonlarla gen ekspresyonunda meydana gelebilecek değişikliklerin daha fazla araştırılmasının faydalı olabileceği düşüncesindeyiz.”
Oxford Nanopore ve GAS Araştırması: Soru-Cevap
GAS enfeksiyonlarının artışını tetikleyen faktörler neler olabilir?
Klinik vakalardaki artışla virülans faktörlerinin doğrudan bir ilişkisi olduğunu düşünüyor musunuz?
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Pandemi sürecinde alınan izolasyon önlemlerinin, özellikle çocuklarda veya yaşlılar gibi duyarlı gruplarda hassasiyete neden olmuş olabileceğini düşünüyorum. Pandemi sonrasında artan GAS vakalarının, bu grupların 2 sene boyunca herhangi bir mikroorganizma ile karşılaşmamalarının ardından normalleşme sürecinde birdenbire karşılaşılan mikroorganizmalardan daha agresif bir etki gördüklerini öngörüyorum. Ayrıca COVID enfeksiyonuyla ortaya çıkan immün yanıt değişikliklerinin bir sonucu olarak basit enfeksiyon türlerinde bile ağır etkiler görebiliyoruz. Bu şekilde gelişen bir immün yanıtın da GAS enfeksiyonunda klinik şiddeti arttırmış olabileceğini düşünüyorum.”
Virülans faktörleri GAS enfeksiyonlarının klinik şiddetini etkileyebilir mi?
Araştırmanızda Sortaz A ve Streptolizin S gibi virülans faktörlerinin varlığını araştırdınız. Bu faktörlerin GAS enfeksiyonlarının klinik şiddeti üzerinde etkisi olabileceğini düşünüyor musunuz?
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Düşünüyorum ancak yürüttüğümüz çalışma bu ifadeyi kanıtlamak için yeterli örnek sayısını karşılamıyor, yani bir pilot çalışma gibi düşünülebilir. Daha fazla sayıda vakadan izolat alınıp sekans yapılarak aynı paterni gösterip göstermediğinin incelenmesi çok kıymetli olur diye düşünüyorum.”
Uzun okuma teknolojisinin araştırmaya sağladığı avantaj nedir?
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Viral bir ajanın sekansını kısa okuma teknolojileriyle yaptığınızda hedeflediğiniz bir gen bölgesi vardır ve buna yönelik primerlerle o bölgenin sekansını çıkarabilirsiniz. Ancak bakterileri bu bağlamda araştırmak için daha geniş bir veri kümesine ihtiyaç vardır. Bu nedenle Oxford Nanopore, bakteri tüm genom dizileme için önemli olan uzun okuma teknolojisini bize sağladı.”
Virülans faktörleri ve genetik analizler erken teşhiste nasıl rol oynayabilir?
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Birincisi ve en önemlisi, ülkemize ait bir veri bankası oluşturulabilir. Ülkemiz için özellikle salgın potansiyeli taşıyan bütün enfeksiyon hastalıkları için böyle bir veri tabanı kıymetli olacaktır. İkinci olarak, kültür yöntemi enfeksiyonun tanımlanması için bir altın standarttır, yine de hız da bizim için oldukça önemli olduğu için hızıyla ön plana çıkan sekans çalışmaların çok önemli bir yeri var. Elbette tüm vakalar için sekanslama yapmak maliyet etkin olmayacaktır ancak sekanslama içeren araştırmalarla diğer tekniklerin kullanımı (kullanılacak primerlerin ve belirteçlerin keşfi gibi) için avantaj sağlar.”
Sekanslama tekniğinin klinikte yaygınlaştırılması için nasıl bir yol izlenebilir?
Seray Karaçay: “Sekanslama tekniği şu anda klinikte kullanılan diğer tekniklere göre biraz pahalı olsa da numune sayılarının artması, Oxford Nanopore özelinde birim maliyeti düşüren bir etkindir. Şirketimiz özelinde ise kliniğe entegrasyon açısından geliştirmekte olduğumuz projeler mevcut. Her örneğe sekanslama yapılmasına ihtiyaç bulunmamakla birlikte özellikle sekanslama ihtiyacı bulunan vakalar vardır. Özellikle kültürlenemeyen veya MaldiTof yönteminden kaçan mikroorganizmalar için de tür tayini sağlayabilmesi, sekanslamayı daha yaygın hale getirecek olan önemli bir nokta.”
Prof. Dr. Gülay Korukluoğlu: “Şahsen bebek hastalarda alınan örneklerin çok kısıtlı olması nedeniyle sekanslamanın önemli olduğunu düşünüyorum. Duyarlı veya onkolojik hasta grupları gibi atipik immün yanıt gösteren hastalarda da fırsatçı enfeksiyonların tanımlanmasında hız kazandıracaktır.”
Oxford Nanopore Teknolojileri kullanıcılarının geri bildirimleri nasıl?
Seray Karaçay: “Oxford Nanopore Teknolojileri de biz Massive Bioinformatics de yalnızca bu alanda değil; kanser, çevre, ziraat, zooloji gibi çeşitli alanlarda hizmet veriyoruz. Yine de mikrobiyoloji bizim için daha özel bir alan, oldukça optimize ve oturmuş bir sistemimiz var. Dolayısıyla mikrobiyoloji alanında çalışan kullanıcılarımıza gönül rahatlığıyla cihazları sunabiliyoruz. Örneğin hedefli PCR yöntemiyle hastanın kliniğini açıklayamayan bir müşterimiz, vakayı shotgun dizileme ile aydınlatmak istiyordu. Örneğini bize gönderdikten sonra sekanslama sayesinde örneğinde hangi mikroorganizmaların olup olmadığını tespit edebildik. Özellikle Oxford Nanopore’un optimizasyonunu ve doğruluk oranlarını arttırmasıyla geri dönüşlerimiz de iyiden daha iyiye doğru gidiyor!”