ACMG Kuralları

2013 yılında ACMG grup üyeleri bir araya gelerek varyantların geçerli kurallar kullanılarak sınıflandırılması için standart terminoloji kullanılmasına yönelik bir öneri geliştirmiştir. Söz konusu kuralın özelliğini taşıyan varyantları sınıflandırmak için farklı kurallar/kriterler atanır. Aşağıda belirtildiği gibi, her kuralın sıklık ve işlevsellik gibi çeşitli bilgi biçimleriyle ilgili benzersiz özellikleri vardır. [1]

Kılavuza göre iki kriter seti belirlenmiştir: biri iyi huylu ve olası iyi huylu sınıflandırma için, diğeri ise patojenik ve olası patojenik sınıflandırma için. ACMG tarafından belirlenen toplam 28 kural vardır. Bunlardan 20 tanesi Massive Analyser’a entegre edilmiş olsa da, sekiz tanesi daha fazla hastaya özgü veriye ihtiyaç duyulması nedeniyle hala kullanılamamaktadır. Uygulanmayan kurallar şunlardır:

PS4, PM3, PM6, PP1, PP4, BS4, BP2, BP5

1. Benign Kurallar

Bu kurallar, atanan varyantı iyi huylu sınıflandırmaya yaklaştırır.

1.1. BA1 (Benign, Stand Alone)

Ekzom dizileme projesi, gnomAD, 1000Genomes veya Exome Aggregation Consortium’da (ExAC) toplam alel frekansı 0,05 eşiğinden büyükse Kural BA1 uygulanır.

İstisna listesi ACMG kılavuzuna göre sistemimize entegre edilmiştir. İlgili makaleyi buradan görebilirsiniz. İstisna olarak tanımlanan varyant uyarı işareti ile gösterilecektir.

1.2. BS1 (Benign, Strong)

Bu kural varyantlara atanırken, ClinVar muhtemel iyi huylu veya iyi huylu gönderimleri kontrol edilir ve gnomAD frekans veritabanı kullanılır. Burada, toplam alel frekansına göre varyant için en yüksek GnomAD alel frekansını bulur ve bunu gen istatistiklerinden elde edilen iyi huylu kesme frekansı ile karşılaştırırız. Nadir hastalıklar için, çok az bilinen varyant varsa (6’dan az), eşik değeri olarak 0.015’i kullanırız.

Çifte sayımdan kaçınmak için, önce BA1 veya PM2 kurallarından biri atanmışsa BS1 kuralı atanmaz.

1.3. BS2 (Benign, Strong)

Öncelikle Klinik Genomik Veri Tabanı’ndan (CGD) gelen verilere göre genin kalıtım şekli belirlenir, ardından alel sayısı bu eşik değerlerle karşılaştırılır:

• Çekinik veya X’e bağlı genler için: 3’ten büyük alel sayısı
• Baskın genler için: 5’ten büyük alel sayısı.

1.4. BS3 (Benign, Strong)

Bu kural literatürdeki in vitro veya in vivo fonksiyonel çalışmaları kontrol eder.

İşlevsel çalışmalar varyantın iyi huylu olduğunu gösteriyorsa bu kural atanır. Massive Analyser bu kuralla ilgili verileri ClinGen Evidence Repository‘den alır.

1.5. BP1 (Benign, Supporting)

Öncelikle kesici varyantların hastalığa neden olduğu bilinen bir gendeki yanlış anlamlı varyant.

Massive Analyser, dbNFSP veritabanından elde edilen MVP skorunu kullanır.

MVP skoru: Derin öğrenme yaklaşımını kullanan yanlış anlamlı varyantlar için bir patojenite tahmin skoru. MVP skoru 0 ile 1 arasında değişmektedir. Skor ne kadar büyükse, varyantın patojenik olma olasılığı o kadar yüksektir. Yazarlar, zarar verici ve toleranslı varyantları ayırmak için 0,7 ve 0,75 eşik değerlerini önermektedir. Ayrıntıları burada görebilirsiniz.

• Gen istatistikleri de bu kuralda kullanılır.

Her gen için yanlış anlamlı varyantlar ve bu varyantların ClinVar klinik anlamlılık sonuçları sayılmıştır. İyi huylu ve muhtemel iyi huylu yanlış anlamlı varyantların toplam yanlış anlamlı varyantlara oranı 0,5’ten büyük ve MVP skoru 0,75’ten küçükse ilgili varyanta BP1 atanmıştır.

1.6. BP3 (Benign, Supporting)

Bilinen bir işlevi olmayan tekrarlayan bir bölgede çerçeve içi delesyonlar/insersiyonlar.

• Bu kural, sonuç ve tekrarlayan bölge bilgilerine göre atanır.
• Massive Analyser tekrarlayan bölge bilgisini UCSC veritabanı simpleRepeat veritabanından alır.

Not: hg38 tabanlı analiz için, hg19 bölgeleri UCSC LiftOver aracı kullanılarak hg38’e kaldırılmıştır.

Varyant sonuçları; inframe insertion, inframe deletion veya stop lost’tan biri veya daha fazlasıysa ve varyant konumu tekrarlayan bölgelerdeyse, BP3 varyanta atanır.

1.7. BP4 (Benign, Supporting)

Çok sayıda hesaplamalı kanıt, gen veya gen ürünü üzerinde herhangi bir etki olmadığını göstermektedir.

Bu kural siliko patojenite skorlarına göre atanır. Bu kural için kullanılan yazılımlar şunlardır:

• Polyphen2
• SIFT
• SIFT4G
• MetaLR
• CONDEL
• DEOGEN2
• FATHMM
• PROVEAN
• MutationTaster
• MutationAssessor
• LRT
• REVEL

Patojenite sonuçları -1 olarak sayılırken, iyi huylu sonuçlar 1 olarak sayılır. Bu puanlar her varyant için toplanır. Toplam puan 0’dan BÜYÜK ise BP4 atanır.

1.8. BP6 (Benign, Supporting)

Güvenilir bir kaynak yakın zamanda varyantı iyi huylu olarak bildirmiştir, ancak bağımsız bir değerlendirme yapmak için laboratuvarda kanıt mevcut değildir.

Varyantın ClinVar klinik yorumu iyi huylu veya muhtemelen iyi huylu ise varyanta BP6 kuralı atanır.

1.9. BP7 (Benign, Supporting)

Bu kural varyant sonuçlarını ve splice-site bölgelerini araştırır. Eğer varyant splice site bölgesinde yer almıyorsa ve eşanlamlı, kodlamayan veya intronik bir varyantsa, BP7 varyanta atanır.

2. Patojenik Kurallar

Bu kurallar, atandıkları varyantı patojenik sınıflandırmaya yaklaştırır.

2.1. PVS1 (Pathogenic, Very Strong)

LOF’un (İşlev Kaybı) bilinen bir hastalık mekanizması olduğu bir gende boş varyant (saçma, çerçeve kayması, kanonik \u00b11 veya 2 ek yeri, başlatma kodonu, tek veya çoklu ekson delesyonu).

Bu kuralda, sonuç sütununu kontrol ederiz. Varyant sonuçlardan bir veya daha fazlasına sahipse:

• anlamsız varyant
• çerçeve kayması varyantı
• ekson delesyonu varyantı
• start loss varyantı
• stop loss varyantı
• splice alıcı varyantı
• splice donor varyantı

Massive Analyser, sonuç bilgilerinden işlev kaybının Bilinen Hastalık Mekanizması olduğunu belirler. İlgili gen için yukarıdaki sonuçlardan bir veya daha fazlasını taşıyan patojenik varyantların toplam sayısı 3’ten fazlaysa, varyanta PVS1 kuralı atanır.

2.2. PS1 (Pathogenic, Strong)

Nükleotid değişikliğinden bağımsız olarak daha önce belirlenmiş bir patojenik varyantla aynı amino asit değişikliği.

Nükleotid değişikliğine bakılmaksızın, varyantta bulunan amino asit değişikliği daha önce başka bir patojenik varyantta tespit edilmişse, varyanta PS1 kuralı atanır.

2.3. PS2 (Pathogenic, Strong)

De novo varyant
De novo varyant, erken embriyogenez sırasında döllenmiş yumurtanın kendisindeki bir varyant nedeniyle bir çocukta ilk kez bulunan genetik bir değişiklik olarak tanımlanır. Massive Analyser bu kuralı sadece trio analizine dahil eder çünkü babalık ve annelik bilgileri sadece trio analizinde kullanılır ve de novo varyantlar trio analizinde tespit edilir

2.4. PS3 (Pathogenic, Strong)

Bu kural literatürdeki in vitro veya in vivo fonksiyonel çalışmaları kontrol eder. İşlevsel çalışmalar varyantın patojenik olduğunu gösteriyorsa PS3 kuralı atanır.

Massive Analyser, PS3 kuralı bilgilerini ClinGen Evidence Repository‘den alır.

2.5. PM1 (Pathogenic, Moderate)

İyi huylu varyasyon olmaksızın mutasyonel bir sıcak noktada ve/veya kritik ve iyi yapılandırılmış bir işlevsel alanda (örneğin, bir enzimin aktif bölgesi) bulunur.

Varyant mutasyonel bir sıcak noktada ve/veya iyi huylu varyasyon olmaksızın kritik ve köklü bir işlevsel alanda bulunuyorsa, PM1 varyanta atanır. Massive Analyser bu kuralla ilgili verileri ClinGen Evidence Repository’den alır.

2.6. PM2 (Pathogenic, Moderate)

Bu kuralda, varyant resesifliği veya baskınlığı hakkında bilgi edinmek için Klinik Genomik Veritabanı kullanılmaktadır.

Kural, gnomAD alel frekansı bilgisi bulunamazsa tetiklenecektir;

• Baskın genler için alel sayısının 20’den az olup olmadığını kontrol ederiz
• Çekinik genler için, alel sayısının 12’den az olup olmadığını kontrol ederiz PM2 atanır.

2.7. PM4 (Pathogenic, Moderate)

Protein uzunluğu, tekrarlanmayan bir bölgedeki çerçeve içi delesyonlar/insersiyonlar veya stop-loss varyantlarının bir sonucu olarak değişir.

• Bu kural, sonuç ve tekrarlayan bölge bilgilerine göre atanır.
• Massive Analyzer tekrarlayan bölgeler veritabanını UCSC veritabanı simpleRepeat veritabanından elde eder.

Varyant tekrarlayan bölgede YER ALMIYORSA ve varyant sonucu şunlardan herhangi biri ise bu kural tetiklenecektir: inframe insertion, inframe deletion, stop lost.

2.8. PM5 (Pathogenic, Moderate)

Patojenik olduğu belirlenen farklı bir missense değişikliğinin daha önce görüldüğü bir amino asit kalıntısında yeni missense değişikliği.

• Bu kural PS1’den daha zayıftır. PS1 kuralında eşit aminoasit değişikliği kontrol edilirken, PM5 kuralı aynı konumdaki tüm olası aminoasit değişikliklerini araştırır.

2.9. PP2 (Pathogenic, Supporting)

Öncelikle kesici varyantların hastalığa neden olduğu bilinen bir gendeki yanlış anlamlı varyant.

• Bu kural BP1’in tam tersidir.

dbNFSP veri tabanından gelen MVP puanını kullanıyoruz.

MVP skoru: Derin öğrenme yaklaşımını kullanan yanlış anlamlı varyantlar için bir patojenite tahmin skoru. MVP skoru 0 ile 1 arasında değişmektedir. Skor ne kadar büyükse, varyantın patojenik olma olasılığı o kadar yüksektir. Yazarlar, zarar verici ve toleranslı varyantları ayırmak için 0,7 ve 0,75 eşik değerlerini önermektedir. Detayları buradan görebilirsiniz.

• Gen istatistikleri de bu kuralda kullanılır.

Her gen için yanlış anlamlı varyantlar ve bu varyantların ClinVar klinik anlamlılık sonuçları sayılmıştır. Patojenik ve muhtemel patojenik missense varyantların toplam missense varyantlara oranı 0,5’ten büyükse ve MVP skoru 0,75’e eşit veya büyükse, ilgili varyanta PP2 atanır.

2.10. PP3 (Pathogenic, Supporting)

Çok sayıda hesaplamalı kanıt, gen veya gen ürünü üzerinde herhangi bir etki olmadığını göstermektedir.

• Bu kural BP4’ün tam tersidir.

Patojenite skorları BP4 kuralında listelenir ve patojenik sonuçlar -1, iyi huylu sonuçlar 1 olarak sayılır. Bu skorlar her varyant için toplanır. Toplam skor 0’dan küçükse PP3 atanır.

2.11. PP5 (Pathogenic, Supporting)

Güvenilir bir kaynak yakın zamanda varyantın iyi huylu olduğunu bildirmiştir, ancak bağımsız bir değerlendirme yapmak için laboratuvarda kanıt mevcut değildir.

• Bu kural BP6’nın tam tersidir.

Varyantın ClinVar yorumu patojenik veya muhtemel patojenik ise, PP5 varyanta atanır.