Genetik analiz ve varyant sınıflandırma süreçleri, tıp dünyasında her geçen gün daha büyük bir önem kazanıyor. Massive Analyser platformu, genetik varyantların tespiti, analizi ve raporlanması süreçlerinde kullanıcılara kapsamlı ve güvenilir bir altyapı sunmak amacıyla sürekli olarak güncelleniyor.
Bu yazıda, Massive Analyser platformunda yapılan son güncellemeler ve iyileştirmelerden, ACMG kurallarına yönelik yapılan değişikliklerden, varyant sonuçlandırma ve transkript önceliklendirme algoritmalarındaki düzenlemelerden ve veri tabanı güncellemelerinden bahsedeceğiz.
ACMG Kurallarına Yönelik Düzenlemeler
Tüm ACMG patojenite kurallarını gözden geçirdik. Özellikle PM2 ve BS2 kurallarında kullanılan veritabanlarını genişleterek sonuçları iyileştirdik. Hiç kural atanmayan varyantları VUSii’den VUS’a değiştirdik.
Varyant Sonuçları ve Transkript Önceliklendirme
Massive Analyser, tespit edilen ve varyant tablosunda sunulan her bir varyantın yol açtığı sonucu Ensembl tarafından belirlenen varyant sonuçları kapsamında sunar. Bu sonuçlar arasında Upstream Gene Variant ve Downstream Gene Variant ögeleriyle ilgili düzenlemeler yaptık. Gen bölgesinin dışında, gene ait “upstream” ve “downstream” bölgelerde gözlemlenen bu varyantların bazı durumlarda ilişkilendirildikleri gene uzak ve başka genlere daha yakın olduğunu gözlemledik. Bunun üzerine, bu varyant sonuçlandırmalarını, gene ait upstream ve downstream bölgelerin 500 bp uzaklığında olmasıyla sınırlandırdık. Artık bu sınır dışında kalan varyantlar, bu varyant sonuçlarıyla birlikte tabloda listelenmemektedir.
Massive Analyser, bir varyasyona ait tespit edilen bütün transkriptler arasından en önemli görüleni önceliklendirip varyant tablosuna sunan ve geri kalan transkriptleri varyanta ait ayrı bir sekmede listeleyen bir algoritmaya sahiptir. Bu algoritmada değerlendirilen özellikler arasında transkriptlere ait canonical olma durumu, patojenisite sınıfı, MANE Select durumu gibi kriterler gözetilmektedir. Yeni versiyonla birlikte Ensembl tarafından belirlenen transkript önem sıralamasını da gözetip en öncelikli transkriptin değerlendirilmesini sağlıyoruz.
Veri Tabanları
Massive Analyser bünyesinde bulunan ve kullanıcılara sunulan veri tabanlarını periyodik olarak güncelledik. Güncellemelerle birlikte yapılan veritabanı düzenlemeleri kapsamında HPO veri tabanında gözlemlenen uyumsuzlukları giderdik. Varyantlara ait HPO terimlerinin birden fazla defa gözükmesi problemini çözdük, fenotip/gen ilişkilendirilmesindeki sorunları düzelttik. Bununla birlikte, popülasyon veri tabanlarından gelen değerler üzerinde düzenlemeler yaptık. Tam değeri gözükmeyen ve 0 olarak listelenen frekans değerlerinin tam değerlerinin görünmesini sağladık.
Güncellenen veritabanları:
- ClinGen – V1.0.29 (iki haftada bir güncellenmektedir)
- ClinVar (periyodik olarak iki haftada bir güncellenmektedir)
- CGD – July 01, 2024
- HPO – 2024-08-13
- dbNFSP – V4.8C
- Ensembl VEP – V112
- Morbid genes – 2024-08
- genCC
Off-Target Varyantlar
Sisteme yüklediğiniz örneklerin analizi esnasında yükleme ekranında seçtiğiniz kitler kullanılmaktadır. Analizler, seçtiğiniz kitlerin kapsadığı genomik bölgeler kapsamında yapılıp sonuçlandırılmaktadır. Analizde kullanılan kite ait bölgelere yakın konumlanan varyantların dahil edilmesi adına, kit dosyasında bulunan her bir bölgenin baş ve uç bölgelerine 10 bp alan ekledik.
IGV – Varyant Tablosu Değişiklikleri
Massive Analyser platformunda her bir örneğin analizi sonucu Genom Görselleştirme sekmesinde sunulan gömülü IGV üzerinde görülen varyantların tabloda gözükmemesi ya da yanlış bilgilerle gözükmesine yönelik düzenlemelerde bulunduk. Bu durumu düzeltmek adına gömülü IGV kısmında kullanılan BAM dosyasını, analizlerimizde yer alan GATK tarafından oluşturulan BAM dosyası ile değiştirdik ve varyant tablosunda GATK tarafından belirlenen yönergeler doğrultusunda düzenlemeler yaptık.
Germline analizlerinde kullanılan HaplotypeCaller isimli varyant çağırma algoritmasının yerel de novo hizalama yaparak ürettiği BAM dosyası, özellikle insersiyon varyantlarında hizalama algoritması olan BWA-MEM algoritmasına kıyasla daha doğru sonuçlar üretmekte ve buna ek olarak tek örnek analizlerinde bile okumaları haplotiplendirerek okuma bazlı zigosite atamasına kıyasla daha doğru zigosite atamaları yapabilmektedir.
HaplotypeCaller algoritmasının kalite filtrelerinden geçen her okumaya bilgilendirici olmayan okuma denir. Bir okumanın bilgilendirici olması için, bölgede haplotiplendirmeleri destekleyen okumaların baz düzeyindeki olasılık analizleri yapılarak ilgili lokasyondaki bazın genotiplendirmesi yapılır. Baz düzeyindeki hesaplamalar sonucunda bir bazın varlığı diğer baz alternatiflerine göre istatistiksel olarak önemli düzeyde bir farka sahip değilse ilgili okumadan baz düzeyinde bir çıkarım yapılmaz ve okuma allel derinliği ve total derinlik hesaplamalarına dahil edilmez. Haplotiplendirme ve varyant çağırmanın detayları için tıklayınız.
Bu bilgiler doğrultusunda, daha güvenilir oldukları için bilgilendirici olan okumaları Allele Derinliği ve Derinlik değerlerine dahil etmeyi uygun görüyoruz. Ancak varyant incelemesinin daha sağlıklı olabilmesi açısından hem hizalama algoritmasından elde edilen hem de varyant çağırma algoritmasından elde edilen BAM dosyalarını bilgisayarınızdaki IGV programına yönlendirilmesini sağlıyoruz.
ACMG Onkojenisite Kurallarına Yönelik Düzenlemeler
Tüm ACMG onkojenite kurallarını gözden geçirdik. Kullanılan veritabanlarını genişlettik.
AMP Tier Sınıflandırmaları
Tier sınıflandırmasını en iyi ve doğru şekilde yapabilmek için kendi biomarker veritabanımızı oluşturduk. Kurallar ise şu şekildedir:
- Tier I-A: Varyantın o kanser tipi için spesifik bir onaylı ilaç karşılığı varsa atanır.
- Tier I-B: Varyantın o kanser tipi için güçlü çalışmalar yapılmış bir ilaç karşılığı varsa atanır.
- Tier II-C: Varyantın farklı bir kanser tipi için spesifik bir onaylı ilaç karşılığı varsa atanır.
- Tier II-D: Varyant için sınırlı klinik veya preklinik çalışmalar varsa atanır.
- Tier III (VUS): Klinik önemi bilinmeyen varyantlara atanır.
- Tier IV: İyi huylu veya muhtemelen iyi huylu varyantlara atanır.
- Unclassified: Herhangi bir sınıfa dahil olamayan varyantlar unclassified olarak sınıflandırılır.
COSMIC Primary Site/Primary Histology
Artık somatik örnek yüklerken, örneğin birincil doku ve birincil histoloji bilgilerini girdi olarak alıyoruz. Bu özellikle varyant değerlendirmenin doğru yapılması açısından önemli bir gelişme olup yukarıda detayları açıklanan Tier sınıflandırması bu bilgiler ışığında yapılmaktadır.
Otomatize PDF Sonuç Raporu
Germline analizlerde seçtiğiniz varyantları veya tüm patojenik/olası patojenik varyantları PDF raporu olarak indirebilirsiniz.
Somatik analizlerde ise analizlere ait iş akışı içerisinde oluşturulan, onkojenisite ve Tier sınıflandırmaları, MSI ve TMB sonuçlarını içeren PDF raporu indirebilirsiniz. İş akışı sonucunda oluşturulan otomatize PDF raporunda onkojenik, muhtemel onkojenik, Tier I-A, Tier I-B, Tier II-C veya Tier II-D sınıflandırmalarını almış varyantlar raporlanmaktadır. Bununla beraber numuneye ait Mikrosatellit Instabilite (MSI) hesaplaması yapılmakta ve %20’den yüksek sonuçlar instabil mikrosatellit, %20’den düşük sonuçlar ise stabil mikrosatellit bölgesine işaret eder. MSI hesaplamasının yanı sıra Tümör Mutasyon Yükü (TMB) hesaplamaları, çoğalttığı alan 1 megabazdan uzun olan kitler için hesaplanmakta ve NCCN kılavuzlarına uygun olarak tümör mutasyon yükü 10 mutasyon/megabaz’dan yüksek olan örneklerde tümör mutasyon yükü yüksek olarak değerlendirilmektedir.