“Behçet Sendromu Hastalarında Cilt Florasının Mikrobiyom Analizi” konulu webinarımızda Oxford Nanopore Teknolojileri ile yapılan dizileme çalışmalarının Behçet Sendromu’nda nasıl kritik bulgular sunduğunu derinlemesine inceledik. Mikrobiyoloji alanında yapılan çalışmalara ve araştırmalarınıza katkı sağlayacak önemli bilgiler sunması amacıyla webinarı kaçıranlar için bir özet hazırladık:
Behçet Sendromu (BS) etiyolojisi bilinmeyen, kronik, her boyut ve tipteki damarları tutabilen, birçok organı etkileyebilen multisistemik bir vaskülittir. Yaklaşık 90 yıl önce Türk dermatolog Hulusi Behçet tarafından tanımlanmış olmasına rağmen hala etiyolojisinin bilinmemesi ve patolojisinin yeterince aydınlatılamaması nedeniyle çalışmaya açık bir konudur. Behçet hastalarında paterji olarak ifade edilen bir aşırı duyarlılık durumu vardır. Hastaların çoğu paterji pozitiftir yani bir iğnenin deriye batırılması sonucu 48 saatte bölgede papül veya püstül gelişir.
Webinarda ele alınan çalışma, 30 adet paterji pozitif ve 30 adet paterji negatif hastanın cilt floralarının inceliyor. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi’nde iç hastalıkları alanında rol alan Dr. Betül Saraç’ın uzmanlık tezi kapsamında, Prof. Dr. Gülen Hatemi’nin danışmanlığıyla çalışılmıştır. Mikrobiyoloji odaklı deneyler ise Gazi Üniversitesi’nden, tezin ikinci danışmanı olan Prof. Dr. Ayşe Kalkancı ve ekibi tarafından yürütülmüştür.
DNA İzolasyonu
Prof. Dr. Ayşe Kalkancı; hastalardan deri örneği alınması için sürüntü, kazıntı, yapışkan bant ve biyopsi yöntemleri kullandıklarını ve literatürde sürecin optimizasyonu için araştırma gereksinimini vurguladı. Çalışmayı en iyi DNA kalitesini aldıkları sürüntü örnekleriyle sürdürdüler. Deriden hem bakteriyel hem de fungal DNA’yı elde edebilmek için izolasyon sırasında guanidin tamponunu kullanmaları, onlara temiz bir DNA izolatı sağladı.
DNA Dizileme
DNA örnekleri Massive Bioinformatics tarafından dizilenmek ve analiz edilmek üzere teslim alındı. Bu süreci İbrahim Halil Miraloğlu PhD., kullanılan Oxford Nanopore Teknolojileri’nin bakteriyal ve fungal tür tayini için uygunluğundan bahsederek anlatmaya başladı. Bakterilerin tür tayininde kullanılan 16S rRNA bölgesi, V1’den başlayarak V9’a kadar uzanan hiperdeğişken bölgelere sahiptir. Kısa okuma tekniklerini kullanan dizileme teknolojileri bu yapının yalnızca V3-V4 bölgesini kapsarken Nanopore’un uzun okuma tekniği tüm yapıyı dizileyebilir. Fungal tür tayininde ise aralarında 5.8S yapısı bulunan ITS1 ve ITS2 rRNA bölgeleri (özellikle ITS1) belirleyicidir. Yapıların tamamını dizileyebilmesi Nanopore’a, kısa okuma tekniğini kullanan teknolojilerin eksik kaldığı “tür seviyesinde çözünürlük” özelliğini kazandırır. Nanopore’un kütüphane hazırlığı kiti ve 16S/ITS1 primerleriyle bölgeler PCR’da hızlıca çoğaltıldı. Elde edilen amplikonların uçlarına barkodlar ve ardından ligasyonla adaptörler bağlandı. Flow cell’e yüklenen örnekler MinION Mk1C cihazıyla dizilendi.
Oxford Nanopore Teknolojileri ile Dizileme
Oxford Nanopore Teknolojileri’nin uzun okuma tekniğinin prensibi: Örnekte yer alan DNA molekülleri, adaptörler ile akış hücresi (flowcell) içerisinde motor proteinlerine bağlanır ve membrandaki porlardan geçmeye başlar. Her bir bazın üç boyutlu yapısı farklı olduğu için pordan geçerken aynı zamanda membranın ayırdığı bir bölgeden diğerine geçen iyonların konsantrasyonunu da değiştirir. Bu elektriği ölçen bir dedektör sinyalleri bilgisayara gönderir ve basecalling aşamasıyla hangi sinyalin hangi baza karşılık geldiği çözümlenir.
Biyoinformatik Analiz
Dizileme verilerini içeren FASTQ dosyaları belli iş akışlarından geçerek DNA dizilerinin hangi organizmalara yakın olduğu veritabanlarından bulunur. Örneğin içinde ne kadar miktarda, hangi türden bulunduğu anlaşılır. Böylece alfa/beta çeşitlilik, PCA, PCoA, biyomarker analizleri gerçekleştirilebilir.
- Alfa çeşitlilik: Bir mikrobiyal topluluğun yapısını zenginliğine (taksonomik grupların sayısı), eşitliğine (grupların bolluğunun dağılımı) veya her ikisine göre özetler. Shannon, Chao1, Simpson’s gibi indekslerle ölçümlenebilir.
- Beta çeşitlilik: Temel amacı örnekleri hem kendi içinde hem bulundukları grupları birbirleriyle karşılaştırılarak, gruplar veya örnekler arası yapısal durumu gözlemlemektir. PCA ve PCoA analizleriyle veriler yorumlanabilir. Farklı parametrelerin birbirinden anlamlı bir şekilde ayrılıp ayrılmadığını gözlemlemenin iyi bir yoludur.
- Biyomarker analizi (LefSe): LEfSe (Linear Discriminant Analysis Effect Size), biyolojik verilerde farklı gruplar arasında önemli farklar yaratan özellikleri (örneğin organizmalar, genler, işlevler veya OTU’lar) belirlemeye yarayan bir istatistiksel analiz yöntemidir. Bu analiz, gruplar arasındaki istatistiksel farklılıkları tespit eder ve bu farklılıkların biyolojik anlamlılıklarını değerlendirir.
Yapılan bu analizler ışığında İbrahim Halil Miraloğlu PhD., biyoinformatik analizlerin sonuçlarını şöyle yorumladı: “Bakteri popülasyonuna dair alfa çeşitlilikte anlamlı bir fark saptanmamıştı. Beta çeşitlilik analizleri sonucunda paterji pozitif ve negatif grubun bakterilerinin cins ve tür olarak birbirinden farklı olduğu saptanmıştı. Mantar popülasyonunda ise alfa çeşitliliği analizleri sonucunda paterji pozitif Behçet hastalarında mantar tür çeşitliliği daha fazla saptanmıştı. Beta çeşitliliği analizleri sonucunda paterji pozitif ve negatif grupların her ikisinde de cilt floralarında mantar çeşitliliğinde anlamlı bir fark saptanmamıştı. Bakteri ve mantar tür ve cinslerinden hangi gruplarda baskın olarak görüldüğü de ilgili raporlarda belirtilmiştir.” Prof. Dr. Ayşe Kalkancı cinsler arasında Behçet hastalarının sağlıklı insanlara kıyasla baskın Candida popülasyonu taşıdığına vurgu yaptı. Nispeten yeni (2009 yılında) keşfedilen Candida auris türünün biyomarker niteliği taşıdığını ve mikrobiyoloji alanı için araştırılacak büyük bir potansiyel taşıdığını belirtti.
Soru & Cevap
Soru: Türlerin tanımlanması için Oxford Nanopore’un öne çıkma sebebi nedir?
İbrahim Halil Miraloğlu: 16S bölgelerinde 9 hiper değişken bölgenin hepsine bakıp toplamak bile bazen bakterilerin tümünü ayırmaya yetmez. E.Coli ile Shigella gibi iki türün hiper değişken türleri birbirine yakın olması nedeniyle ayırt etmenin zorlaştığı durumlar vardır. Bir yapbozun parçası ne kadar büyük olursa onu yerine koymak ve tanımlamak o kadar kolaylaşır. Böylece ne kadar uzun okuma yapılırsa o kadar çok bölge kapsanır, tür ve alttür seviyesine inme şansı artar.
Soru: Mikrobiyoloji alanında qPCR ile yeni nesil dizileme uygulamalarının farkları nelerdir?
İbrahim Halil Miraloğlu: qPCR çalışmalarında tekniğin bir prensibi olarak primerler kullanılır. Bunlara veri tabanlarından ulaşılacağı için önceden tanımlanmış türler olmaları gerekir. Bu nedenle hedefli çalışmak gerektiğinden örneğin kompozisyonu tarafsız bir şekilde açığa çıkarılamaz. Sadece belirlenen bakterilerin var ya da yok şeklinde analizi yapılabilir. Yeni nesil dizileme ise patojen-agnostik yaklaşımıyla tarafsız bir şekilde türleri ortaya koyar.
Soru: Paterji pozitif ve negatif hastalarda bakteriyel kompozisyon açısından ne tür farklar gözlemlediniz?
Prof. Dr Ayşe Kalkancı: “Mantar kompozisyonunun aksine örneklerin kendi içinde zenginlik açısından bir fark gözlemlemedik. Ancak sağlıklı bireylerin gram pozitif ağırlıklı kompozisyonunun aksine tümü Behçet hastalarından oluşan örneklem kümemizin Proteobacteria ağırlıklı olduğunu gördük. Filumun bu denli farklılaşması önemli bir veri sağladı. Tür seviyesinde saptadıklarımız ise yalnızca genom analiziyle birbirine ayırt edebileceğimiz, besiyerinde fenotipik yöntemlerle ismini koyamayacağımız türlerdi.”
Soru: Biyoinformatik analiz sırasında gözünüze çarpan farklı bir durum oldu mu?
İbrahim Halil Miraloğlu: “Hayır, olmadı. Ancak belirtmeliyim ki örneğin alınması, saklanması, DNA izolasyonu gibi downstream aşamalar, upstream biyoinformatik analizleri etkileyebiliyor. Elde edilecek verinin kalitesini sağlamak için deneyin planlanması sırasında bu tür aşamalara dikkat etmek önemli.”
Soru: Bu alanda çalışmak isteyen genç araştırmacılara ne gibi tavsiyelerde bulunursunuz?
Prof. Dr Ayşe Kalkancı: “Literatürü iyi araştırıp gerçekten özgün olan, daha önce araştırılmamış olan konular seçmek önemli. Özgün bir konu bulduktan sonra iyi bir hipotez kurmak ve iyi bir teknik yöntem izlemek gerekir. Ardından elde edilen verinin üzerine yeni sorular sormayı, çalışmayı ilerletmeyi, çıktıyı genişletmeyi öneririm.”
İbrahim Halil Miraloğlu: Bildiğiniz gibi son dönemde mikrobiyom araştırmaları önem kazandı. Ancak bu konuda bakteriyom daha ön plana çıkıyor. Sizce mikobiyom da bireylerin hayatını bu kadar etkiliyor mu, mikrobiyom analizlerinde yer verilmesi gereken bir parametre olur mu?
Prof. Dr Ayşe Kalkancı: “Mikobiyomun oldukça yeni, yani yaklaşık on yıldır araştırılmasının sebebi konunun bilinmiyor oluşu değil, teknik yetersizliklerdi. Mikobiyom konusu, korunmuş bir bölge olarak ITS’lerin kısa kısa okunmasıyla sınırlı kaldı. Oxford Nanopore’un uzun okuma tekniği ile mantarların takson verisini elde edebilmeye başladık.”